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DNA甲基化与检测方法简介

  DNA甲基化和检测方法

  提到遗传,我们已经习惯了ACGT这四个碱基按排列顺序存在的基因组编码信息的概念。然而,甲基化修饰如胞嘧啶及其分布,组蛋白乙酰化等也会影响表型。这构成了表观遗传学的主要研究。其实早在1942年,C.H. Waldinton提出了表观遗传学的概念,他指出表观遗传和遗传相关,主要研究基因型和表型。而现在,对表观遗传学的更统一的理解是,它在没有改变的核DNA序列的情况下研究基因功能的可逆遗传变化。换句话说,在不改变基因组序列的前提下,DNA甲基化(DNA甲基化)是通过DNA和组蛋白修饰最常见的基因调控,并成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的进展,科学家开始在基因组水平上研究表观遗传学,逐渐形成表观基因组学。表观遗传学是对整个基因组水平的表观遗传过程的研究,以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的鉴定和鉴定。
2000年10月,由欧盟赞助的人类基因组联盟(Human Epigenome Consortium)发起了人类第6号染色体MHC区域试点项目DNA甲基化概况的第一项举措。该项目成功完成,于2003年启动了人类基因组计划(HEP)。2005年,美国国立卫生研究院国立癌症研究所(NIH)启动了癌症基因组试验项目。 2006年,该研究所和国家人类基因组研究所共同启动了癌症基因组计划。表观基因组学和DNA甲基化与癌症研究已成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化和CpG岛,癌症和DNA甲基化以及DNA甲基化的重要检测方法。 CpG岛DNA甲基化:
CpG岛DNA甲基化:在人类表观遗传学研究中,最常见的是胞嘧啶二核苷酸CpG甲基化修饰。主要过程是在CpG甲基化结合蛋白(MBDs)和DNA甲基转移酶(DNMTs)的作用下,改变CpG二核苷酸5端的胞嘧啶成为5“甲基胞嘧啶。在正常的人类DNA中,大约3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中,约有50,000,000个CpG二核苷酸,其中70%被甲基化。而可被甲基化的CpG二核苷酸不是随机分布在基因组序列中,相反,在基因组的一些区域,通常是基因的启动子区域,5非翻译区和第一外显子区,CpG序列密度是非常高的,比平均值高出5倍以上,作为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区域,称为CpG群岛(CpG群岛,CGIs)。CpG岛屿概念最早被提出由他称为非甲基化HapII小片段(HpaII Tiny Fragment,HTF)的Adrian Bird,更正式的定义是一个区域,该区域具有至少200个碱基对的序列长度,GC含量超过50% CpG比率(观察/预期)超过0.6,CpG比率计算如下:最近,为了排除那些Alu重复,提出了更严格的标准:至少500个碱基对,GC含量超过55% ,CpG比值大于0.65。
\\ u0026 NBSP;据估计,哺乳动物基因组CpG岛约有4万个。在健康的人类基因组中,CpG岛中的CpG位点一般是未甲基化的,CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的。研究表明DNA甲基化在遗传印记,胚胎发育和正常细胞功能的维持中起重要作用。 DNA甲基化与肿瘤
DNA甲基化与肿瘤: DNA甲基化模式和水平的变化是肿瘤发生的重要因素。这些变化包括CpG岛的局部超甲基化和基因组DNA低甲基化状态。如图1左侧所示,在正常细胞中,位于肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛处于低水平或非甲基化状态。此时肿瘤抑制基因处于正常开放状态,肿瘤抑制基因的表达抑制肿瘤的发生。在肿瘤细胞中,该区域的CpG岛高度甲基化,染色质构象发生改变,肿瘤抑制基因表达被关闭,导致细胞进入细胞周期,凋亡减少,DNA修复缺陷,血管生成,和细胞粘附丢失等,最终导致肿瘤。类似地,如图2的右侧所示。如图1所示,对于在正常细胞中高度甲基化的一些基因和重复序列,如果它们的甲基化水平降低,则细胞过度生长,不适当的细胞特异性表达,增加的基因组脆弱性和活化,这些基因将激活并导致基因组印记的丢失内寄生物序列最终也导致肿瘤发生。由于CpG岛甲基化早于恶性增生的细胞,其甲基化检测可用于肿瘤的预测,而全基因组水平的低水平甲基化状态随肿瘤恶性程度的增加而进一步降低,以至于可用于肿瘤的诊断和分级。近年来有不断的研究表明,人类肿瘤的发生,发展与DNA甲基化的异常有关,特异性基因的异常甲基化可以在肿瘤的临床诊断中早期发现。因此,甲基化可作为肿瘤早期诊断的生物标志物和预后指标,对癌症的筛查和风险评估,早期诊断,分期,预后和治疗监测具有重要意义。 DNA甲基化检测方法:
DNA甲基化检测方法:随着DNA甲基化研究的深入,检测方法层出不穷。这些方法针对不同的研究目的,采用不同的处理方法,几乎​​涵盖了从基因到基因组水平的研究。根据不同的测试样品可以分为DNA和mRNA。现有的大多数方法都是从细胞中提取DNA。根据研究水平,这些方法分为三类:甲基化含量分析,候选基因的甲基化分析,基因组DNA甲基化模式和甲基化分析分析。主要方法如下:1.甲基化分析基因组甲基化水平(甲基化含量):1.高效液相色谱法(HPLC)
\\ u0026> HPLC是一种比较常规的方法,它是根据DNA或蛋白质的分子量和构象的不同而使之分离的。由于动态和稳定期吸光度差异导致的分子吸光度的定量随着系统压力的增加,分辨率也随之增加,因此它可以定量测定基因组中DNA甲基化的总体水平,是由Kuo等人于1980年首次报道的,其工艺是先用盐酸或氢氟酸将DNA样品水解成碱性,然后通过柱子将产物水解,与标准样品进行比较,它的量是用紫外线测量的,5 mC /(5mC + 5C)的积分面积就是基因组的总体甲基化水平,这是检测DNA甲基化水平的标准方法。 2.毛细管电泳(High-Performance Capillary Electrophoresis,HPCE)这是一种融合石英毛细管采用窄口径分离复杂的不同化学工艺的组分秒。其基础是在强电场作用下,不同的分子由于不同的电荷,大小,结构和疏水性而相互分离。使用HPCE方法处理DNA水解产物以确定5mC水平是简单的,成本有效的和敏感的。基于这两种方法,不断有新的方法学改进,包括变性高效液相色谱(DHPLC),反相高效液相色谱(反相HPLC)和高效液相色谱薄层色谱(TLC)结合HPLC-TLC方法。除上述方法外,还有其他原理的检测方法,如简易TLC方法和最佳邻居TLC(Nearest Neighbor TLC),基于抗5mC免疫学技术(Anit-5mC免疫学技术),SssI甲基转移酶(SssI甲基验收测定),基于亚硫酸氢盐处理的氯乙醛反应和酶促区域甲基化测定(ERMA)。
<\\ / strong>必须注意的是,尽管上述各种方法都能清楚地检测到目的序列中所有CpG位点的甲基化状态,但是不能定位甲基化位点。
候选基因(候选基因)甲基化分析:内源性甲基化敏感性限制性内切酶-PCR / Southern方法(甲基化敏感性限制性内切酶-PCR / Southern, MSRE-PCR / Southern)
本方法利用甲基化敏感性限制性酶是甲基化区域特征性的未切割,将DNA消化成各种大小的片段,经Southern或PCR扩增分离产物,明确甲基化状态并分析。通常使用的甲基化敏感性限制酶是HpaII-MspI(CCGG)和SmaI-Xmal(CCCGGG)等。
2.亚硫酸氢盐测序(亚硫酸氢盐测序)在这种方法中,亚硫酸氢盐胞嘧啶DNA甲基化不发生在离氨基转化为尿嘧啶,而甲基化胞嘧啶保持不变,PCR扩增所需片段,尿嘧啶均转化为胸腺嘧啶,最后对PCR产物进行测序并与未处理的序列,以确定CpG位点是否甲基化。该方法准确度高,能够识别目的片段中每个CpG位点的甲基化状态,但需要大量的克隆和测序,过程较为繁琐昂贵。
3. \\ u0026> R(甲基化特异性PCR,MS-PCR)
返回首页R(甲基化特异性PCR,MS-PCR)与用亚硫酸氢盐处理的DNA相同的方法,然后是行特异性引物PCR。设计两对引物与亚硫酸氢盐处理的序列配对,一对经过结合处理的甲基化DNA链和另一对未甲基化的DNA链处理后。如果用针对加工的甲基化DNA链的引物扩增,则MS-PCR扩增产物的检测显示在测试位点的甲基化;反之亦然。 4.甲基化荧光(MethyLight)
4.甲基化荧光(MethyLight)结合测试亚硫酸氢盐处理的DNA片段,互补设计一个探针测试位点区域探针和探针连接到报告荧光的5端和3端淬灭荧光,随后进行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交,Taq DNA聚合酶的Taper 5至3的核酸外切酶活性在PCR引物延伸时在探针序列的5末端裂解报道子荧光,淬灭的荧光不再可用为记者荧光抑制,所以报告荧光灯,可以在甲基化和水平的位置测量每个周期测量的荧光强度。该方法高效,快速,重复性好,样品量大,不需要电泳分离等特点。 5.焦磷酸测序(焦磷酸测序)
该方法通过四种酶的级联反应,在每一轮测序中催化相同的化学反应体系发光反应。在该反应中,仅添加一种dNTP。如果dNTP与模板配对,则聚合酶可将其添加至引物链并释放等摩尔量的焦磷酸(PPi)。 PPi最终可以转化为可见光信号,并通过PyrogramTM转换成与核苷酸数量成正比的峰高。当用于甲基化检测时,亚硫酸氢盐处理的序列可被视为C-T型SNP变化。其操作简单,结果准确可靠,可进行大规模分析。 6.结合酶切(合并亚硫酸氢盐限制性酶切分析,COBRA)
亚硫酸氢盐限制酶切;该方法用亚硫酸氢钠处理DNA样品进行PCR扩增,保留原始的甲基化胞嘧啶,未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶鉴定切割的PCR产物以鉴定原始样品DNA的甲基化状态。这种方法相对简单,不需要预先了解CpG位点和样品序列。全基因组DNA甲基化模式(甲基化模式)与甲基化模式(甲基化模式分析)
基因组DNA甲基化模式(甲基化模式)甲基化模式(甲基化分析)
<\\ / strong>首先将RLGS应用于DNA甲基化的全基因组分析的一种方法。该方法首先用甲基化敏感的稀释限制酶NotI消化基因组DNA。将甲基化位点保留,标记,切割并进行单向电泳,然后对较高频率的甲基化核酸内切酶消化不敏感,进行双向电泳,使甲基化部分在电泳期间切开并显带,获得RLGS图谱缺失带的正常控制是可能的甲基化位点。
2.甲基化区域之间扩增的位点(扩增甲基化位点,AIMS)基于AIMS的任意引物PCR(Arbitrary Primed PCR)是由于使用寡核苷酸连接子进行连接的任意引物PCR,所以不需要依赖任何序列的先验信息。在这种方法中,用于扩增的模板序列首先被甲基化敏感的限制性内切核酸酶消化和富集,其通过消化片段一端的特定序列结合接头的酶特别保证。随后再次被核酸内切酶消化,重新连接,纯化后进行PCR扩增,最后进行电泳提取靶序列进行测序。
3.甲基化CpG岛扩增(甲基化CpG岛扩增,MCA)
甲基化CpG岛扩增(Methyllated CpG-island amplification,MCA) MCA也是一种任意引发的基于PCR的方法,使用两种消化,接着是对甲基化具有不同敏感性的限制性内切核酸酶(例如SmaI和XmaI),然后是接头连接的甲基化敏感限制性片段,PCR和PCR扩增那些CpG-丰富的序列将被选择性放大。这种方法对于甲基化差异基因的甲基化分析和克隆是非常有用的。
4.差异甲基化杂交(Differential Methylation Hybridization,DMH) DMH属于芯片技术,在这项技术中,由扩增子(Amplicon)Generate和CGI文库筛选两个重要组成部分。在扩增子产生中,DNA样品首先用MseI消化,连接到接头,并且去除重复序列。然后将样品分成两份,然后进行PCR扩增以产生仅由MseI处理的样品,另一半用甲基化敏感性酶BstUI消化,然后进行PCR扩增以产生扩增子共处理与MseI / BstUI。对CGI文库进行重复筛选,然后进行PCR,选择含有BstUI位点的克隆。最后,将这些克隆重复在芯片上以制备CGI芯片。然后将两种不同的扩增子分别与相应的CGI克隆点杂交,并通过差异对比检测那些未甲基化的位点。小HpaII片段富集分析(HpaII通过连接介导的PCR富集微小片段,HELP)
HpaII过程用甲基化的敏感同工酶MspI消化相同的基因组序列,产生不同的代表性序列,然后通过接头介导的PCR,Rui He电泳等进行该序列的比较分析,或者通过DNA样品的杂交用于分析的基因组芯片。该方法揭示了大量的组织特异性,差异甲基化区域,并用于正常和癌细胞的比较基因组分析。 6.甲基化DNA免疫沉淀(Methyllated DNA immunoprecipitation,MeDIP)这是一种有效富集甲基化DNA的方法。在该方法中,将与5mC特异性结合的抗体添加至变性的基因组DNA片段,从而免疫沉淀甲基化的基因组片段以形成富集。结合现有的DNA微芯片技术,可以进行大规模的DNA甲基化分析。该方法简便,专属性强,适用于DNA Methylome分析。
<\\ / strong>通过上述讨论,不难看出甲基化检测方法不断出现,他解释了其研究的难度,另一方面也说明了各种方法有其局限性,如酶依赖性,PCR扩增问题,标准化芯片数据分析等等。综上所述,多种表观基因组技术使我们能够绘制详细的模式,如DNA甲基化和组蛋白修饰模式,用于研究甲基化生物学功能和肿瘤发生中的作用,从而为肿瘤的预防,诊断,治疗和预后提供更多的信息。预后。但是,为了实现这个雄心勃勃的目标,不仅需要更多的支持,还需要国际同行的密切合作。
 

  关键词:技术美国2008年标准科学

  
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